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उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) के साथ काम करते समय, विश्वसनीय, गुणवत्ता परिणाम सुनिश्चित करने के लिए अच्छा अंशांकन आवश्यक है। एचपीएलसी उपकरण का उचित अंशांकन एक उपयुक्त अंशांकन मानक बनाने के साथ शुरू होता है। ज्यादातर मामलों में, वास्तव में अंशांकन को एक अंशांकन वक्र के रूप में जाना जाता है जो उत्पन्न करने के लिए एकाग्रता बढ़ाने के मानकों की एक श्रृंखला की आवश्यकता होती है। यह एक प्लॉटेड लाइन और संबद्ध समीकरण है जो रासायनिक परीक्षण की एकाग्रता और एचपीएलसी डिटेक्टर की प्रतिक्रिया के बीच संबंध का वर्णन करता है।
उस रासायनिक को निर्धारित करें जिसे आप एचपीएलसी ("विश्लेषण") का उपयोग करने के लिए परीक्षण करना चाहते हैं। उदाहरण के लिए, आप फ्रुक्टोज सामग्री के लिए शीतल पेय की एक श्रृंखला का परीक्षण करना चाह सकते हैं, जिस स्थिति में फ्रुक्टोज का विश्लेषण होगा।
उपयुक्त शुद्धता के विश्लेषण रसायन की एक मात्रा प्राप्त करें। आम तौर पर शुद्धता 99% से अधिक होनी चाहिए और विश्लेषण एक प्रतिष्ठित रासायनिक आपूर्ति कंपनी से खरीदा जाना चाहिए। फ्रुक्टोज के मामले में, उदाहरण के लिए, आप एक रासायनिक विक्रेता से शुद्ध फ्रुक्टोज खरीदेंगे न कि किराने की दुकान से।
HPLC पर परीक्षण करने के लिए आपके द्वारा लिए गए नमूनों में विश्लेषण की अधिकतम और न्यूनतम प्रत्याशित सांद्रता निर्धारित करें। शीतल पेय के मामले में, आप पेय के लेबल की जांच करेंगे और उन पेय पदार्थों में सबसे कम और उच्चतम फ्रुक्टोज सामग्री का निर्धारण करेंगे जो आप परीक्षण करेंगे। ध्यान रखें कि प्रारंभिक नमूना (सॉफ्ट ड्रिंक) को पतला किया जा सकता है या अन्यथा विश्लेषण के लिए तैयारी के दौरान हेरफेर किया जा सकता है (एचपीएलसी विधि का उपयोग किया जा रहा है पर निर्भर करता है) और इसलिए एचपीएलसी पर इंजेक्ट किए गए नमूनों में विश्लेषण एकाग्रता को संशोधित किया जा सकता है। यह नमूनों में विश्लेषण एकाग्रता है जैसा कि एचपीएलसी पर विचार किया जाना चाहिए।
उस विलायक का निर्धारण करें जिसमें आप अंशांकन मानकों को बनाने के लिए अपने विश्लेषण को भंग कर देंगे। यह विलायक एकाग्रता की एक अपेक्षाकृत विस्तृत श्रृंखला पर विश्लेषण को ठीक से भंग करने में सक्षम होना चाहिए (कम से कम उतने ही उच्च के रूप में नमूनों में आप परीक्षण करना चाहते हैं)। साथ ही, यह विलायक आदर्श रूप से "मोबाइल चरण:" के समान होना चाहिए, जिसका उपयोग एचपीएलसी उपकरण के माध्यम से नमूने ले जाने के लिए किया जाता है।
विश्लेषण के "स्टॉक मानक" समाधान बनाने के लिए आवश्यक विश्लेषण की मात्रा की गणना करें। यह वांछित मात्रा से स्टॉक मानक की आवश्यक एकाग्रता को गुणा करके पाया जाता है। इस समाधान में विश्लेषण की एकाग्रता उच्चतम प्रत्याशित नमूना एकाग्रता से कम से कम 10% अधिक होनी चाहिए। यदि शीतल पेय के नमूने में उच्चतम प्रत्याशित फ्रुक्टोज सांद्रता 8 ग्राम / 100 मिलीलीटर है, तो स्टॉक मानक 10 ग्राम फ्रुक्टोज / 100 मिलीलीटर की एकाग्रता के लिए बनाया जा सकता है। एक उचित मात्रा 500 मिलीलीटर है, इस प्रकार 8/100 एमएल x 500 एमएल = 40 ग्राम फ्रुक्टोज की आवश्यकता होगी।
सटीक के एक उपयुक्त स्तर पर विश्लेषण की आवश्यक मात्रा का वजन। अक्सर एक या दो दशमलव स्थानों के लिए सटीक ग्राम में एक वजन मूल्य उपयुक्त होता है, लेकिन कुछ तरीकों के लिए अधिक सटीक आवश्यक हो सकता है।
आवश्यक वॉल्यूम के वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क के लिए वेटेड विश्लेषण को स्थानांतरित करें और फ्लास्क पर भरने के निशान के लिए वांछित विलायक जोड़ें। वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क (एक स्नातक किए गए बीकर के बजाय, उदाहरण के लिए) का उपयोग स्टॉक मानक एकाग्रता मूल्य की शुद्धता को बढ़ाता है। सुनिश्चित करें कि सभी विश्लेषण फ्लास्क में स्थानांतरित हो गए हैं; यदि आवश्यक हो तो इसे धोने के लिए कुछ विलायक का उपयोग करें।
वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क को रोकें और विश्लेषण पूरी तरह से भंग होने तक धीरे से हिलाएं या उलटें करें।
स्टॉक मानक के अलग-अलग संस्करणों को वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में स्थानांतरित करके, सटीक स्थानांतरण के लिए विंदुक का उपयोग करके, फिर विलायक जोड़कर स्टॉक मानक के अलग-अलग dilutions की एक श्रृंखला बनाएं। निम्नतम मानक एकाग्रता का विश्लेषण किया जाने वाला निम्नतम प्रत्याशित नमूने से नीचे होना चाहिए। शीतल पेय उदाहरण में, यदि नमूने में सबसे कम अपेक्षित फ्रुक्टोज सांद्रता 2 ग्राम / 100 एमएल है, तो 1 ग्राम / 100 एमएल मानक बनाया जा सकता है। यह स्टॉक मानक के दस गुना कमजोर पड़ने से बना होगा। मानक श्रृंखला में कुल 5 या 6 सांद्रता शामिल होनी चाहिए, इसलिए शायद 3, 5 और 8 ग्राम फ्रुक्टोज / एमएल के मानकों का उत्पादन करने के लिए अतिरिक्त dilutions की आवश्यकता होगी। अब आपके पास मानक समाधानों की एक श्रृंखला है जिसके साथ एचपीएलसी को कैलिब्रेट करना है।