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स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री रसायन और जीव विज्ञान में एक अमूल्य उपकरण है। मूल विचार सरल है: विभिन्न पदार्थ प्रकाश / विद्युत चुम्बकीय विकिरण को दूसरों की तुलना में कुछ तरंग दैर्ध्य में बेहतर अवशोषित करते हैं। उदाहरण के लिए, कुछ सामग्री पारदर्शी हैं, जबकि अन्य रंग की हैं। जब आप किसी समाधान के माध्यम से किसी दिए गए तरंग दैर्ध्य की रोशनी को चमकते हैं, तो इसकी एकाग्रता जितनी अधिक होगी, यह उतना ही अधिक प्रकाश अवशोषित करेगा। एकाग्रता की गणना करने के लिए, आपको ज्ञात एकाग्रता के मानकों के लिए रीडिंग के साथ अपने पढ़ने की तुलना करने की आवश्यकता है। नीचे दी गई प्रक्रिया एक काफी सामान्य प्रक्रिया है जिसे रसायन विज्ञान शिक्षण प्रयोगशाला को ध्यान में रखते हुए लिखा गया है, लेकिन इसे अन्य सेटिंग्स के लिए भी संशोधित किया जा सकता है।
हमेशा एक प्रयोगशाला में काम करते समय, अपनी सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए अपने काले चश्मे, दस्ताने और लंबी आस्तीन वाले कोट पर रखें।
रबर बल्ब को हवा में खाली करने के लिए निचोड़ें, फिर इसे अपने स्नातक किए हुए पिपेट के ऊपर रखें और बल्ब को आराम करने दें ताकि यह पाइपेट में पानी को सोख सके। अगला, बल्ब को हटा दें, और अपनी उंगली से पिपेट के शीर्ष को कैप करें; यह पिपेट को सील कर देगा ताकि आपकी उंगली को हटाने तक फ्लो के अंदर का समाधान बाहर न निकले। जब तक आप अपनी वांछित मात्रा तक नहीं पहुंचते, तब तक पिपेट से थोड़ा सा घोल निकलने के लिए अपनी उंगली के किनारे को थोड़ा ऊपर उठाएं। स्नातक किए गए पिपेट कैसे काम करता है, इसके बारे में महसूस करने के लिए कुछ पानी और बीकर के साथ अभ्यास करें। संसाधन अनुभाग के तहत लिंक में एक फिल्म क्लिप है जो आपको दिखाती है कि एक पाइपसेट का उपयोग कैसे करें यदि आपने पहले कभी एक के साथ काम नहीं किया है।
मानकों 1-5 के रूप में 5 परीक्षण ट्यूबों को लेबल करें। आप उन्हें मास्किंग टेप और एक पेन का उपयोग करके या एक सूखी मिटा मार्कर का उपयोग करके लेबल कर सकते हैं।
अपने मानकों के लिए पाँच सांद्रता चुनें। आप चाहते हैं कि मानक सांद्रता एक ही अंतराल के बारे में एक दूसरे से अलग हो जाएं - जैसे, 0.1 मोलर, 0.2 मोलर, 0.3 मोलर, इत्यादि - और उसी सीमा के बारे में जो आप अपने अज्ञात की अपेक्षा करते हैं। कुछ समय के लिए, निम्नलिखित पाँच सांद्रता का उपयोग करें, लेकिन याद रखें कि आपको अपना प्रयोग करते समय इन्हें संशोधित करना होगा:
मानक 1: 0.1 मोलर मानक 2: 0.2 मोलर मानक 3: 0.3 मोलर मानक 4: 0.4 मोलर मानक 5: 0.5 मोलर
अगला, 1 मोलर मानक समाधान लें और टेस्ट ट्यूब 1-5 में निम्नलिखित मात्राएं जोड़ें। याद रखें, इन राशियों की गणना ऊपर सूचीबद्ध सांद्रता का उपयोग करके की जाती है, इसलिए आपको अपना प्रयोग करते समय आवश्यकतानुसार इन्हें संशोधित करना पड़ सकता है।
मानक 1: 0.8 मिलीलीटर मानक 2: 1.6 मिलीलीटर मानक 3: 2.4 मिलीलीटर मानक 4: 3.2 मिलीलीटर मानक 5: 4 मिलीलीटर
स्नातक की उपाधि प्राप्त पिपली कुल्ला, तो विआयनीकृत पानी की निम्नलिखित मात्रा में स्थानांतरण:
मानक 1: 7.2 मिलीलीटर मानक 2: 6.4 मिलीलीटर मानक 3: 5.6 मिलीलीटर मानक 4: 4.8 मिलीलीटर मानक 5: 4.0 मिलीलीटर
मूल रूप से, विचार प्रत्येक ट्यूब में समाधान की मात्रा को 8 मिलीलीटर तक लाने का है।
पैराफिल्म के साथ मानकों में से प्रत्येक को कैप करें और उन्हें मिश्रण करने के लिए उल्टा करें।
एक और पांच टेस्ट ट्यूब को "अज्ञात 1-5" के रूप में चिह्नित करें। मानकों के लिए 1 दाढ़ समाधान के साथ अपने अज्ञात या परीक्षण समाधान की एक ही मात्रा जोड़ें। दूसरे शब्दों में, अज्ञात 1 में 0.8 मिलीलीटर परीक्षण समाधान और 7.2 मिलीलीटर पानी होगा, अज्ञात 2 में 1.6 मिलीलीटर परीक्षण समाधान और 6.4 मिलीलीटर पानी, और आगे होगा।
पैराफिल्म के साथ अज्ञात में से प्रत्येक को कैप करें, और मिश्रण करने के लिए सावधानीपूर्वक पलटें।
स्पेक्ट्रोफोटोमीटर चालू करें और इसे गर्म होने दें। आवश्यक समय की लंबाई मॉडल और निर्माता पर निर्भर करेगी।
स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर तरंग दैर्ध्य सेट करें। तरंगदैर्ध्य आपके प्रयोग में रासायनिक के प्रकार पर निर्भर करेगा। अभी के लिए, 500 एनएम मान लें, हालांकि याद रखें कि आपको विभिन्न प्रयोगों के लिए इसे बदलने की आवश्यकता होगी।
अपने स्पेक्ट्रोफोटोमीटर को कैलिब्रेट करें। आपके द्वारा उपयोग किए जा रहे डिवाइस के आधार पर अंशांकन प्रक्रिया अलग-अलग होगी। शिक्षण प्रयोगशालाओं में एक सामान्य मॉडल स्पेक्ट्रोफिक 20 के लिए, आप पहली बार मशीन को समायोजित करेंगे ताकि यह "0 प्रतिशत टी" पढ़े जब कोई क्युवेट लोड नहीं होता है, तो इसे समायोजित करें ताकि यह "100% टी" पढ़े जब एक खाली क्यूबाइट विआयनीकृत हो जाए केवल पानी भरा हुआ है। ये प्रक्रिया आपके द्वारा उपयोग की जा रही मशीन के आधार पर भिन्न हो सकती है, इसलिए विवरण के लिए निर्माता निर्देशों से परामर्श करें।
मशीन के कैलिब्रेट होने के बाद, मानक 1 टेस्ट ट्यूब लें और एक साफ क्युवेट में सामग्री डालें, जब तक कि वे भरने की रेखा तक नहीं पहुंच जाते। किसी भी अंगुलियों या अन्य गंदगी को हटाने के लिए क्युमवेट से क्युवेट को पोंछ लें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में क्युवेट डालें और "% T" पढ़ने को रिकॉर्ड करें।
सभी 10 नमूनों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि आपके परिणाम यथासंभव सटीक हैं, नमूनों के बीच क्युवेट को साफ करने के लिए CERTAIN का उपयोग करें।
अपने मानकों के लिए परिणाम लें और उन्हें एक्सेल या ओपनऑफ़िस जैसे स्प्रेडशीट / ग्राफ़िंग प्रोग्राम में दर्ज करें।
स्प्रेडशीट प्रोग्राम का उपयोग करते हुए, मानकों के लिए "% T" मूल्यों में से प्रत्येक द्वारा 100 प्रतिशत विभाजित करें, फिर परिणाम का लॉग लें। यह गणना आपको अवशोषक प्रदान करेगी। यदि आप सूत्र इनपुट करते हैं, तो आपका स्प्रेडशीट प्रोग्राम आपके लिए गणना करेगा।
उदाहरण: यदि% T 50.6 है, तो स्प्रेडशीट प्रोग्राम में आपके द्वारा डाला गया सूत्र निम्नानुसार होगा:
लॉग (100 / 50.6)
स्प्रेडशीट प्रोग्राम अंकगणित करेगा।
सभी पाँच अज्ञात / प्रायोगिक मूल्यों के लिए एक ही करें।
एक्स-अक्ष पर एकाग्रता और y- अक्ष पर अवशोषण के साथ, सभी पांच मानकों के लिए अवशोषण मूल्यों को ग्राफ़ करें। स्प्रेडशीट प्रोग्राम का उपयोग करते हुए, इस ग्राफ़ में एक रेखीय समीकरण फिट करें। समीकरण फॉर्म y = mx + b का होगा। अधिकांश स्प्रेडशीट कार्यक्रमों में एक रेखीय प्रतिगमन फ़ंक्शन होगा। रैखिक प्रतिगमन सुविधा का उपयोग करने के तरीके के बारे में जानकारी के लिए अपने स्प्रेडशीट प्रोग्राम के लिए उपयोगकर्ता मैनुअल से परामर्श करें।
अपने स्प्रेडशीट प्रोग्राम से सर्वश्रेष्ठ-फिट लाइन के लिए समीकरण लें और इसे बी से दोनों तरफ से घटाकर और दोनों पक्षों को m से विभाजित करके हल करें। परिणाम निम्न की तरह दिखेगा:
(y - b) / m = x
जहाँ b और m आपके स्प्रेडशीट प्रोग्राम द्वारा पाए गए मान हैं।
अज्ञात लोगों के लिए अपने अवशोषण मूल्यों की जांच करें, और तीनों को चुनें जो मानकों के समान रेंज में आते हैं। अपनी शेष गणना के लिए इन तीन अवशोषण मूल्यों का उपयोग करें। यदि सभी पांच मानकों के अनुसार एक ही श्रेणी में आते हैं, तो आप इसके बजाय सभी पांच का उपयोग कर सकते हैं, लेकिन आपको कम से कम तीन का उपयोग करने की आवश्यकता है।
Y के स्थान पर अपने समीकरण में तीन अवशोषण मूल्यों में से प्रत्येक को प्लग करें। याद रखें कि आपका समीकरण निम्न रूप में था:
(y - b) / m = x
तो, आप y के स्थान पर समीकरण में प्रत्येक अज्ञात के लिए अवशोषक मान को प्लग करना चाहते हैं, फिर x की गणना करें। आप इस गणना को करने के लिए स्प्रेडशीट प्रोग्राम का उपयोग कर सकते हैं और इसे जल्दी कर सकते हैं। आपने अब अपने तीन अज्ञात क्षेत्रों में रुचि के रसायन की एकाग्रता की गणना की है। इन अज्ञात को तैयार करने के लिए मूल समाधान को पतला कर दिया गया था, हालांकि, अब आपको कमजोर पड़ने वाले कारक के आधार पर मूल समाधान की एकाग्रता की गणना करने की आवश्यकता है।
प्रत्येक अज्ञात नमूना जिसे आपने स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में डाला था, एक अलग राशि से पतला था। नतीजतन, अब आपको निम्नलिखित द्वारा प्रत्येक अज्ञात पढ़ने के लिए अवशोषण के आधार पर गणना की गई एकाग्रता को विभाजित करना चाहिए:
अज्ञात 1: विभाजित करें 0.1 अज्ञात 2: विभाजित करें 0.2 अज्ञात 3: विभाजित करें 0.3 अज्ञात 4: विभाजित करें 0.4 अज्ञात 5: विभाजित करके 0.5
हालांकि, याद रखें कि ये आंकड़े इस धारणा पर आधारित हैं कि आप ऊपर उल्लिखित dilutions का उपयोग कर रहे हैं। इन मूल्यों को बदलने के लिए याद रखें यदि आपने अपने नमूनों को एक अलग मात्रा में पतला किया है।
अपने परिणामों को एक साथ जोड़ें, और उन्हें परिणामों की संख्या से विभाजित करें। यह आपको एक औसत देगा। मूल समाधान की एकाग्रता के लिए अपनी खोज के रूप में इस संख्या की रिपोर्ट करें।