विषय
उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) एक प्रयोगशाला तकनीक है जिसका उपयोग यौगिकों को अलग करने और पहचानने के लिए किया जाता है। यह एक प्रकार का स्तंभ क्रोमैटोग्राफी है जो एक विलयन में यौगिकों के विभिन्न ध्रुवों पर निर्भर करता है ताकि उन्हें अलग किया जा सके। एचपीएलसी मानक कॉलम क्रोमैटोग्राफी से भिन्न होता है क्योंकि यह स्तंभ के माध्यम से समाधान को अधिक तेज़ी से बाध्य करने के लिए दबाव का उपयोग करता है, और इसलिए जल्दी और कभी-कभी अधिक सटीक, परिणाम उत्पन्न करता है। लक्ष्य स्तंभ में यौगिकों को अलग करना है और उन्हें अलग से बाहर निकलना है।
Coelution
एचपीएलसी की गति के कारण और यह यौगिकों के विभिन्न ध्रुवों पर निर्भर करता है, समान संरचना और ध्रुवता वाले दो यौगिक एक ही समय या लगभग एक ही समय में क्रोमैटोग्राफी तंत्र से बाहर निकल सकते हैं। यह coelution के रूप में जाना जाता है। तालमेल यह निर्धारित करता है कि मिश्रण का कौन सा भाग किस बिंदु पर कठिन है।
Adsorbed यौगिक
एचपीएलसी आमतौर पर विभिन्न सामग्रियों से बने मोतियों से भरे एक ग्लास कॉलम का उपयोग करता है। स्तंभ के माध्यम से मजबूर किए जा रहे मिश्रण में रसायन होते हैं जो मोतियों को अलग-अलग ताकत से बांधते हैं। बंधन की ताकत, जो ध्रुवीयता में समानता पर निर्भर करती है, यह निर्धारित करती है कि रसायन रिलीज होने से पहले कितनी देर तक मनका को बांध देगा। कुछ यौगिक इतनी दृढ़ता से बाँधते हैं कि वे अनिवार्य रूप से स्तंभ में स्थित मोतियों से कभी मुक्त नहीं होते हैं और स्तंभ से बाहर निकलने वाले समाधान में कभी नहीं मापा जाता है।
लागत
विशिष्ट प्रयोगशाला पृथक्करण तकनीकों में एक परख, या पृथक्करण की विधि विकसित करना शामिल है, और फिर एक समाधान से अलग-अलग यौगिकों को अलग करने के लिए उस परख को लागू करना। हालांकि यह आमतौर पर कई समाधानों में परिणत होता है, जिन्हें प्रक्रियाओं से गुजरना पड़ता है, जिससे जटिलता में तेजी से वृद्धि होती है। हालांकि एचपीएलसी अक्सर इस प्रक्रिया को सरल और तेज कर सकता है, एचपीएलसी उपकरण विकसित करने की लागत जबरदस्त हो सकती है। एक एचपीएलसी उपकरण विकसित करना, हालांकि अधिक कुशल, यौगिकों को अलग करने के लिए अन्य assays के विकास की तुलना में बहुत अधिक महंगा है। यह कई छोटे निजी स्वामित्व वाली प्रयोगशालाओं के लिए वित्तीय रूप से व्यवहार्य नहीं है।
जटिलता
एचपीएलसी का उपयोग न केवल सरल यौगिकों को अलग करने के लिए किया जाता है, इसका उपयोग सेलुलर मिश्रण से विशिष्ट प्रोटीन को अलग करने के लिए भी किया जाता है। इस मामले में कॉलम में मोतियों को आमतौर पर प्रोटीन के लिए एक एंटीबॉडी के साथ लेपित किया जाता है जिसे आपको इकट्ठा करने की आवश्यकता होती है। प्रोटीन एंटीबॉडीज को बांधते हैं और शेष समाधान कॉलम के माध्यम से पारित किया जाता है, फिर प्रोटीन को दूसरे समाधान का उपयोग करके जारी किया जाता है और एकत्र किया जाता है। इसके लिए हर समय स्तंभ की निगरानी के लिए एक उच्च कुशल तकनीशियन की आवश्यकता होती है और यह सुनिश्चित करें कि प्रक्रिया बिल्कुल नियोजित चल रही है।