विषय
एक एंजाइम द्वारा उत्प्रेरित रासायनिक प्रतिक्रियाओं में, एंजाइम सब्सट्रेट के साथ अस्थायी रूप से संबंध बनाने और इसे एक तनावपूर्ण स्थिति में घुमाकर सक्रियण ऊर्जा की मात्रा को कम करता है। प्रतिक्रिया के लिए कश्मीर (उत्प्रेरक) या "केकट" उस दर के लिए एकाग्रता-स्वतंत्र स्थिरांक को संदर्भित करता है, जिस पर एक विशेष एंजाइम एक सब्सट्रेट को उत्पाद अणु में चयापचय कर सकता है। केसीएटी की गणना करने के लिए, वैज्ञानिक पहले सब्सट्रेट की अलग-अलग सांद्रता (एक "एंजाइमी परख" के रूप में जाना जाता है) के साथ कई परीक्षण ट्यूबों को मिलाते हैं और उत्पाद अणुओं की बढ़ती सांद्रता को मापने के लिए एक हल्के स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ निरंतर समय अंतराल पर परीक्षण करते हैं। यह डेटा फिर एक ग्राफ पर प्लॉट किया जाता है और विश्लेषण किया जाता है।
प्रारंभिक वेगों की गणना
एंजाइटी assays से पहली परीक्षण ट्यूब के लिए समय बनाम उत्पाद एकाग्रता का एक चार्ट प्लॉट करें। नोट: क्षैतिज अक्ष "समय" होना चाहिए और ऊर्ध्वाधर अक्ष "उत्पाद एकाग्रता" होना चाहिए।
खंड 1, चरण 1 में दिए गए डेटा बिंदुओं के लिए रेखीय प्रतिगमन रेखा की गणना करें। जबकि एक्सेल और रेखांकन कैलकुलेटर इस रैखिक मॉडल को आसानी से निर्धारित कर सकते हैं, आप निकटवर्ती डेटा द्वारा उत्पाद एकाग्रता में अंतर को विभाजित करके प्रतिगमन लाइनों के ढलान का अनुमान लगा सकते हैं। समय में उनके अंतर से अंक।
धारा 1, चरण 2 से रैखिक प्रतिगमन रेखा की ढलान को "प्रारंभिक प्रतिक्रिया वेग (Vo)" के रूप में दर्ज करें। नोट: प्रतिगमन लाइन मॉडल में "= m + b," गुणांक "m" ढलान है।
परख में बाकी परीक्षण ट्यूबों के लिए चरण 1, 2 और 3 दोहराएं।
Vmax की गणना
प्रत्येक टेस्ट ट्यूब के लिए सब्सट्रेट एकाग्रता का व्युत्क्रम प्लॉट करें। इसके प्रारंभिक प्रतिक्रिया वेग (धारा 1, चरण 4 से) के व्युत्क्रम में। उदाहरण के लिए, यदि 50 माइक्रोमोलर (यूएम) की प्रारंभिक सब्सट्रेट एकाग्रता के साथ एक टेस्ट ट्यूब के लिए प्रारंभिक वेग 80 uM / s था, तो व्युत्क्रम सब्सट्रेट एकाग्रता के लिए 1/50 uM और प्रारंभिक के लिए 1/80 uM / s होगा। वेग। नोट: उलटा सब्सट्रेट एकाग्रता क्षैतिज अक्ष पर होना चाहिए, और उलटा प्रारंभिक वेग ऊर्ध्वाधर अक्ष पर होना चाहिए।
नोट: सब्सट्रेट एकाग्रता क्षैतिज अक्ष पर होना चाहिए, और प्रारंभिक प्रतिक्रिया वेग ऊर्ध्वाधर अक्ष पर होना चाहिए।
चरण 2, चरण 1 में दिए गए चार्ट के लिए रैखिक प्रतिगमन लाइन का निर्धारण करें। नोट: क्योंकि आपको प्रतिगमन लाइन के लिए y-प्रतिच्छेद को जानना होगा, आपको धारा 2, चरण 1 से बिंदुओं को एक्सेल या ए में दर्ज करना चाहिए। कैलकुलेटर रेखांकन और निर्मित प्रतिगमन मॉडलिंग कार्यक्षमता का उपयोग करें।
रैखिक प्रतिगमन रेखा से y-intersect द्वारा 1 को विभाजित करें। यह आपको एंजाइम के अधिकतम प्रतिक्रिया वेग, Vmax के व्युत्क्रम का मूल्य देगा। नोट: यदि रेखीय प्रतिगमन मॉडल "= m + b" रूप लेता है, तो "b" का मान y-प्रतिच्छेद होगा। Vmax के व्युत्क्रम की गणना करने के लिए 1 "b" से विभाजित करें।
Vmax के वास्तविक मूल्य की गणना करने के लिए धारा 2, चरण 3 के परिणाम से 1 को विभाजित करें।
मूल परख में एंजाइम की एकाग्रता का निर्धारण (कच्चे डेटा देखें)। नोट: एंजाइम एकाग्रता सभी परीक्षण ट्यूबों के लिए समान है; केवल सब्सट्रेट सांद्रता परख में भिन्न होते हैं।
एंजाइम एकाग्रता (धारा 2, चरण 5 से) द्वारा Vmax (धारा 2, चरण 4 से) को विभाजित करें। परिणाम केसीएटी का मूल्य है।