चिपचिपा अंत एंजाइमों का उपयोग करने के लाभ

विषय

• प्रतिबंध एंजाइम और प्रतिबंध साइटें
• सही ओरिएंटेशन
• Ligating स्टिकी एंड्स को कम डीएनए की आवश्यकता होती है
• विभिन्न एंजाइम समान चिपचिपा अंत दे सकते हैं

आणविक क्लोनिंग एक आम जैव प्रौद्योगिकी विधि है जिससे हर छात्र और शोधकर्ता को परिचित होना चाहिए। एक प्रकार के एंजाइम का उपयोग करके आणविक क्लोनिंग ने मानव डीएनए को टुकड़ों में काटने के लिए एक प्रतिबंध एंजाइम कहा जाता है जिसे तब बैक्टीरिया सेल के प्लास्मिड डीएनए में डाला जा सकता है। प्रतिबंध एंजाइमों ने आधे में दोहरे फंसे डीएनए को काट दिया। प्रतिबंध एंजाइम के आधार पर, कट का परिणाम या तो एक चिपचिपा अंत या एक कुंद अंत हो सकता है। आणविक क्लोनिंग में चिपचिपे सिरे अधिक उपयोगी होते हैं क्योंकि वे सुनिश्चित करते हैं कि मानव डीएनए का टुकड़ा सही दिशा में प्लास्मिड में डाला जाता है। डीएनए के टुकड़ों की बंधाव प्रक्रिया, या फ़्यूज़िंग के लिए डीएनए की कम आवश्यकता होती है जब डीएनए चिपचिपा होता है। अंत में, एकाधिक चिपचिपा अंत प्रतिबंध एंजाइम एक ही चिपचिपा अंत का उत्पादन कर सकते हैं, भले ही प्रत्येक एंजाइम एक अलग प्रतिबंध अनुक्रम को पहचानता है। इससे संभावना बढ़ जाती है कि चिपचिपा अंत एंजाइमों द्वारा आपके डीएनए क्षेत्र को काट दिया जा सकता है।

प्रतिबंध एंजाइम और प्रतिबंध साइटें

प्रतिबंध एंजाइम एंजाइम होते हैं जो डबल-फंसे डीएनए पर विशिष्ट अनुक्रमों को पहचानते हैं और उस क्रम में डीएनए को आधे में काटते हैं। मान्यता प्राप्त अनुक्रम को प्रतिबंध स्थल कहा जाता है। प्रतिबंध एंजाइमों को एंडोन्यूक्लाइज़ कहा जाता है क्योंकि वे दोहरे-फंसे डीएनए को काटते हैं, जो कि डीएनए सामान्य रूप से मौजूद है, उन स्थानों पर जो डीएनए के छोर के बीच में हैं। 90 से अधिक विभिन्न प्रतिबंध एंजाइम हैं। प्रत्येक एक विशिष्ट प्रतिबंध स्थल को पहचानता है। प्रतिबंध एंजाइम अपने संबंधित प्रतिबंध साइटों को अन्य साइटों की तुलना में 5,000 गुना अधिक कुशलतापूर्वक प्राप्त करते हैं जो वे नहीं पहचानते हैं।

सही ओरिएंटेशन

प्रतिबंध एंजाइम दो सामान्य वर्गों में आते हैं। वे या तो चिपचिपे सिरों में डीएनए को काटते हैं या कुंद समाप्त होते हैं। एक चिपचिपा अंत में न्यूक्लियोटाइड्स का एक छोटा क्षेत्र होता है, जो डीएनए का निर्माण खंड है, जो कि अप्रकाशित है। इस अनपेक्षित क्षेत्र को ओवरहांग कहा जाता है। ओवरहांग को चिपचिपा कहा जाता है क्योंकि यह चाहता है और एक और चिपचिपा अंत के साथ जोड़ेगा जिसमें पूरक ओवरहांग अनुक्रम है। चिपचिपे सिरे लंबे-खोए हुए जुड़वा बच्चों की तरह होते हैं जो एक बार मिलने के बाद एक-दूसरे को कसकर गले लगाना चाहते हैं। दूसरी ओर, कुंद सिरे चिपचिपे नहीं होते हैं क्योंकि सभी न्यूक्लियोटाइड डीएनए के दो स्ट्रैंड के बीच पहले से ही जोड़े जाते हैं। चिपचिपा सिरों का लाभ यह है कि मानव डीएनए का एक टुकड़ा केवल एक दिशा में एक जीवाणु प्लास्मिड में फिट हो सकता है। इसके विपरीत, यदि मानव डीएनए और बैक्टीरियल प्लास्मिड दोनों का कुंद अंत होता है, तो मानव डीएनए को प्लास्मिड में सिर से पूंछ या पूंछ से सिर जोड़ा जा सकता है।

Ligating स्टिकी एंड्स को कम डीएनए की आवश्यकता होती है

हालांकि, स्टिक एंड वाले डीएनए को एक-दूसरे को "स्टिकनेस" के कारण खोजने में आसान समय होता है, लेकिन न तो चिपचिपा सिरा होता है और न ही कुंद सिरे डीएनए के निरंतर टुकड़े में एक साथ फ्यूज हो सकते हैं। डीएनए के एक निरंतर टुकड़े का गठन जो पूरी तरह से जुड़ा हुआ है, एक एंजाइम की आवश्यकता होती है जिसे लिगेज कहा जाता है। Ligases चिपचिपे या कुंद छोर पर न्यूक्लियोटाइड्स की रीढ़ को जोड़ता है, जिसके परिणामस्वरूप न्यूक्लियोटाइड्स की एक सतत श्रृंखला होती है। क्योंकि एक दूसरे के प्रति आकर्षण के कारण चिपचिपे सिरे एक दूसरे को तेजी से पाते हैं, लिगेशन की प्रक्रिया के लिए कम मानव डीएनए और कम प्लास्मिड डीएनए की आवश्यकता होती है। डीएनए और प्लास्मिड के कुंद छोरों को एक दूसरे को खोजने की संभावना कम होती है, और इस तरह कुंद छोरों के बंधाव की आवश्यकता होती है कि अधिक डीएनए टेस्ट ट्यूब में डाल दिया जाता है।

विभिन्न एंजाइम समान चिपचिपा अंत दे सकते हैं

प्रतिबंध स्थल जीवों के जीनोम में स्थित होते हैं, लेकिन समान रूप से नहीं होते हैं। प्लास्मिड में, उन्हें एक दूसरे के ठीक बगल में स्थित होने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है। जो वैज्ञानिक मानव जीनोम से मानव डीएनए के एक टुकड़े को काटना चाहते हैं, उन्हें प्रतिबंध के क्षेत्र के सामने और पीछे के प्रतिबंध स्थलों को खोजना होगा। यह सुनिश्चित करने के अलावा कि डीएनए टुकड़ा सही दिशा में डाला गया है, विभिन्न चिपचिपा अंत एंजाइम समान चिपचिपा अंत बना सकते हैं, भले ही वे अलग-अलग प्रतिबंध अनुक्रमों को पहचानते हैं। उदाहरण के लिए, BAMHI, BglII, और Sau3A के पास अलग-अलग मान्यता अनुक्रम हैं लेकिन एक ही GATC चिपचिपा अंत का उत्पादन करते हैं। यह इस संभावना को बढ़ाता है कि आपके मानव हित के जीन को फ्लिक करने वाले चिपचिपे अंत प्रतिबंध स्थल होंगे।