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सेल का आनुवंशिक नीला उसके आनुवंशिक पदार्थ या डीएनए के भीतर कूटबद्ध होता है। चूंकि डीएनए कोशिका के नाभिक को कभी नहीं छोड़ता है, इस जानकारी के लिए साइटोप्लाज्म में जाने के लिए जहां अन्य प्रोटीन और जैव रासायनिक घटक रहते हैं, पहले डीएनए को दूत आरएनए (एमआरएनए या पॉली (ए) आरएनए) में बदलना आवश्यक है। यह mRNA तब प्रोटीन में अनुवादित हो जाता है जो कोशिका के कई कार्य करता है। बहुत दुर्लभ mRNAs का पता लगाने या इसकी मात्रा निर्धारित करने के लिए, माइक्रोएरे के लिए जांच करें या पूरक डीएनए अणुओं के पुस्तकालयों का निर्माण करें, mRNA को अलग किया जाना चाहिए। हालांकि, कुल आरएनए (यानी एक सेल में सभी आरएनए) निष्कर्षण और बाद में एमआरएनए अलगाव परस्पर अनन्य प्रक्रिया नहीं हैं; पूर्व mRNA निकाले जाने के लिए किया जाना चाहिए।
कुल आरएनए से mRNA का अलगाव
TRIzol होमोजेनाइजेशन: कुल RNA में सभी mRNA, स्थानांतरण RNA, राइबोसोमल RNA और अन्य नॉनकोडिंग RNA शामिल हैं। इन्हें अन्य कोशिकीय घटकों से अलग करने के लिए, इसकी सामग्री को छोड़ने के लिए कोशिका को पहले खुला रखा जाता है। यह TRIzol अभिकर्मक (लाइफ टेक्नोलॉजीज) में सेंट्रीफ्यूगिंग (तेज गति से घूमते हुए) द्वारा चलाई गई कोशिकाओं के पुनरुत्पादन द्वारा किया जाता है। TRIzol के अन्य संस्करण (जैसे Ambion की TRI अभिकर्मक) समान रूप से काम करते हैं।
कुल आरएनए अलगाव: निलंबन के भीतर परतों में या चरणों में सेल के विभिन्न घटकों (प्रोटीन, डीएनए, आरएनए) को अलग करने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन की एक श्रृंखला का उपयोग किया जाता है। शीर्ष, पीले रंग का चरण वसा से बना होता है और इसे त्याग दिया जा सकता है। वांछित चरण को लाल रंग में रंगा जाता है, जिसमें कुल आरएनए होता है और इसे बरकरार रखा जाता है। आइसोप्रोपेनॉल और इथेनॉल का उपयोग करके एक फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और अल्कोहल वॉश की एक श्रृंखला का प्रदर्शन करने के बाद, आरएनए को एमआरएनए अलगाव के लिए पेलेट किया जा सकता है। इस एंजाइम को कुल आरएनए को नीचा दिखाने से रोकने के लिए RNase अवरोधक जोड़ें।
mRNA निष्कर्षण: mRNAs को अलग करने के लिए किट का उपयोग करना आम है, क्योंकि होममेड लैब प्रोटोकॉल अत्यधिक शुद्ध mRNAs की बड़ी मात्रा उत्पन्न नहीं करते हैं। वाणिज्यिक किट में इन्विट्रोजेन की फास्टट्रैक 2.0 या एंबियन की पॉली (ए) शुद्ध mRNA अलगाव किट शामिल हैं। ये बुनियादी कदम इस तरह के किट के लिए आम हैं:
क) कुल आरएनए के 300 माइक्रोलिटर के साथ किट में प्रदान किए गए आरएनएस-अवरोधी लसीक बफर को मिलाएं।
बी) 65 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए गरम करें और फिर तुरंत बर्फ पर नमूना को एक मिनट के लिए ठंडा करें।
ग) इसे 0.5 एम सोडियम क्लोराइड के साथ मिलाएं और फिर इस नमूने में ओलीगो डीटी (ऑलिगोडॉक्सीथिमाइक्लिक एसिड) को पूरी तरह से भंग कर दें।
डी) इस नमूने को अपकेंद्रित्र करें और सतह पर तैरनेवाला को ठीक करें, जो कि किटों में प्रदान किए गए बाध्यकारी और कम नमक बफ़र्स की एक श्रृंखला में कई बार धोया जाता है।
ई) किट-निर्दिष्ट मात्रा (उदाहरण के लिए ५०० माइक्रोलिटर) प्राप्त होने तक कई बार mRNA को हटाएं।
च) सोडियम एसीटेट और इथेनॉल वर्षा द्वारा एलिप को रोकना। Diethylpyrocarbonate (DEPC) -treated पानी के 20 microliters तक फिर से निलंबित।
छ) -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा गुणवत्ता और मात्रा की जांच करें।